Fragestellungen zur Strukturaufklärung an flexiblen Molekülen umfassen Konfigurations- und Konformations-, aber keine Konstitutionsaufklärung. Zu deren vollständiger Beschreibung kommen die aus der Karplus-Kurve, dem Nuclear Overhauser Enhancement (NOE) und den Residual Dipolar Couplings (RDC) extrahierbaren Informationen in Betracht. Diese Methoden sollten sich komplementär verhalten, sodass jede Methode zusätzliche Informationen über das System beinhaltet und somit zum Verständnis beiträgt. Besonders wichtig ist hierbei, dass die Daten in ausreichend hoher Genauigkeit extrahiert und die durch konformationelle Flexibilität erzwungenen Mittelungsprozesse korrekt beschrieben werden.
Die Genauigkeit der Extraktion von Kopplungskonstanten und damit von RDC-Daten ist ausbaufähig. Daher wurden am starren Molekül (+)-Isopinocampheol 1 Methoden evaluiert, die durch Unterdrückung von homonuklearen Kopplungen Multiplettstrukturen vereinfachen und Linienbreiten reduzieren. Dazu wurden mittels den neu entwickelten Experimenten BIRD-CLIP-HSQC und perfectBIRD-CLIP-HSQC Kopplungskonstanten und deren Fehler bestimmt. Diese Kopplungskonstanten wurden sowohl im isotropen als auch im anisotropen Medium gemessen. Es konnte gezeigt werden, dass mit diesen Experimenten eine genauere Kopplungskonstanten- und RDC-Bestimmung als mit dem CLIP-HSQC möglich ist. Besonders für überlappende Signale ist diese Methode von erheblichem Vorteil, aber auch nicht-überlappende Signale profitieren vom Genauigkeitsgewinn. Ein Nachteil der Methode ist aber die niedrige Sensitivität, sodass sie trotz der höheren Genauigkeit in der Folge nicht eingesetzt wurde. Zweifellos hat diese Methode aber hohes Zukunftspotential.
Evaluation der Genauigkeit der RDC-Extraktion aus CLIP-Experimenten
Evaluation der Genauigkeit der RDC-Extraktion aus CLIP-Experimenten
Die Extraktion von genauen Abständen aus NOE-Daten wurde ebenfalls evaluiert. Zur Beschreibung konformationeller Flexibilität wurde eine Software entwickelt, die korrekt gemittelte Abstände und experimentelle Abstände vergleicht. Beides wurde an Strychnin 2 erprobt, da dieses Molekül nur sehr geringe Flexibilität aufweist.
Durch den Einsatz von Strychnin 2 als Testmolekül konnte durch systematischen Ausschluss der möglichen Fehlerquellen gezeigt werden, dass die von Butts et al. postulierte Flexibilität[1] tatsächlich vorhanden ist. Dazu wurden die experimentellen Voraussetzungen der vollständigen Relaxation und des Ausschlusses von Sauerstoff als paramagnetischem Relaxationspartner ebenso kontrolliert wie die korrekte Verwendung von Nullquantenunterdrückung und die Abwesenheit von Spindiffusion. Dies geschah durch die von Edwards entwickelte Simulation von Abständen unter dem Einfluss konformationeller Flexibilität mit der Software SPINACH, die die Interpretation unterstützten. Zusätzlich wurde die Auswertungssoftware WEEDHEAD entwickelt, die konformationelle Flexibilität und dessen Einfluss auf beobachtete Abstände aus NOE-Daten korrekt beschreibt. So konnten Konformerenpopulationen von 98% für das Haupt- und 2% für das Nebenkonformer beschrieben werden. Gleichzeitig konnte so eine weitere postulierte Flexibilität ausgeschlossen werden. Durch Vergleich mit RDC-Daten konnte außerdem gezeigt werden, dass die NOE-Analyse in diesem Fall der RDC-Analyse überlegen ist.
Im nächsten Schritt wurde die Robustheit dieser Methode an α-Methylen-γ-butyrolacton 3 getestet. Dieses Molekül besitzt neben der Ringflexibilität eine frei rotierbare Methylgruppe, deren korrekte Beschreibung ebenfalls in WEEDHEAD implementiert wurde. Durch die so extrahierten Distanzen konnte die per RDC-Analyse bestimmte Relativkonfiguration[2-3] ebenso bestätigt werden wie die Konformerenpopulationen. So konnte gezeigt werden, dass sowohl die NOE- als auch die RDC-Analyse das gleiche Ergebnis liefern. Eine Kombination beider Methoden wird als ideal angesehen, da so die Stärken beider Methoden genutzt werden können. Als Stärke der NOE-Analyse wird dabei die Detektion von Änderungen kurzer Distanzen angesehen, während RDC-Daten besonders bei weit voneinander entfernten Molekülteilen durch ihren globalen Charakter hilfreich sind.
[1] C. P. Butts, C. R. Jones, J. N. Harvey, Chem. Commun. 2011, 47, 1193–1195.
[2] C. M. Thiele, V. Schmidts, B. Böttcher, I. Louzao, R. Berger, A. Maliniak, B. Stevensson, Angew. Chem. 2009, 121, 6836–6840.
[3] C. M. Thiele, A. Marx, R. Berger, J. Fischer, M. Biel, A. Giannis, Angew. Chem. 2006, 118, 4566–4571.